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MTT法細胞活性檢測

產品型號: iCell-CRO04
產品時間: 2019-06-03
描述:MTT法細胞活性檢測
MTT檢測法,是一種檢測細胞存活和生長增殖的方法。
檢測原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,用酶標儀在490nm波長(或其他波長)處測定其光吸收值,在一定細胞數量範圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

產品介紹

MTT檢測法,是一種檢測細胞存活和生長增殖的方法。
檢測原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,用酶標儀在490nm波長(或其他波長)處測定其光吸收值,在一定細胞數量範圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值),來判斷活細胞數量,OD值越大,細胞活性越強(如果是測藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。
該方法靈敏度高、經濟實用,已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模藥物篩選、細胞毒性試驗以及細胞放射敏感性測定等等。
 

MTT主要有兩個用途:(1)藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;(2)細胞增殖及細胞活性測定。

MTT法細胞活性檢測

MTT方法能簡單、快捷、準確地測定細胞的增殖反應,並且其價格低廉,成為日前各實驗室檢測細胞活性的shou選方法之一。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值,在一定細胞數範圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)來判斷活細胞數量,OD值越大,細胞活性越強(如果是測藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。

 

一、MTT 溶液的配製

1、MTT 溶液的配製通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市麵上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g。對於100mg這樣的小包裝,廠家都是將MTT放入小管中的,個人建議不要再用天平稱量分裝,而應該一次性將其全配製成溶液,如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法:預先在50ml離心管(沒有的話,可用培養瓶替代)加入20ml PBS,從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中,吹打若幹次後將其移入50ml離心管,然後再混勻。可以重複幾次,以使小管中的MTT不殘留於管內。將MTT完全混勻後,用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裏的細菌,分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存於-20℃。按細胞培養板每孔需加10ul計算,一般每96孔板約需1ml,所以分裝時可考慮每管分裝1ml。對於大包裝,可按上述方法稱取一部分溶解,也有人將粉劑分裝在EP管裏,用的時候現配,直接往培養板中加。

2、注意事項:

(1)在配製和保存的過程中,容器用鋁箔紙包住。

(2)配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感。

(3)MTT一般現用現配,過濾後4℃避光保存兩周內有效,或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存,避免反複凍融,小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為灰綠色時就不能再用。

(4)MTT有致癌性,使用時需小心。

MTT法細胞活性檢測

二、MTT甲瓚溶解液

1、二甲基亞碸DMSO:可以直接溶解,無需配製,使用方便,溶解速度快,但對人體毒性較大,且需去除原培養液,在去除培養液的過程中,可能會把結晶去掉,導致結果不穩定。

2、三聯溶解液:SDS10g,異丁醇5ml,10M HCl 0.1ml,用雙蒸水溶解配成100ml溶液,該溶解液不需去除原培養基,但溶解較慢。該溶解液因含有SDS,在低溫保存的時候易產生結晶,因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,將SDS結晶全部溶解後再使用。

 

三、MTT法實驗步驟

1、胰酶消化對數期細胞,終止後離心收集,製成細胞懸液,細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。

2、將細胞懸液製備好後,輕輕混勻,每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。

注意:因細胞在混勻後仍要繼續沉降,因此接種的過程中要反複多次混勻,如每加6個孔就混勻一次,以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同,這對於MTT的結果至關重要。

3、將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物。原則上,細胞貼壁後即可加藥(兩小時——半天時間),但绿巨人破解版无敌版常在前一天下午鋪板,次日上午加藥。一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個複孔,建議設6個,否則難以反應真shi情況。 

注意:對於加藥,有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中,以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好,然後將96孔板中的培養上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養基,這樣能保證藥物濃度的準確。另外,需注意的是,如果用這種方法,不要把96孔板的培養液全部吸走後再加藥,應該吸完一部分後立即加樣,避免由於96孔板幹燥引起細胞死亡。

4、5%CO2,37℃孵育16-48h,倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。 

5、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。 

6、終止培養,準備溶解結晶。

溶解結晶的方法有兩種,用DMSO溶解:

1)用DMSO溶解: MTT加入培養4h後,結晶可充分形成。將上清去掉,該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走,也有人建議先鋪幾張濾紙在桌麵,然後將96孔板輕輕倒置,這樣上清便被濾紙吸走,以減少結果的損失。 

2) 每孔加入150ul二甲基亞碸,置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

另一種方法,用三聯溶解液:

1) MTT加入培養4h後,結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(該溶解液因含有SDS,在低溫保存的時候易產生結晶,因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,將SDS結晶全部溶解後再使用。)

2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時,鏡下觀察,待結晶全部溶解後570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右,紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少,溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多,溶解的時間會長一些。

7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞碸),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸)。

 

四、MTT結果分析

關於如何計算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm:lg 大劑量

I:lg(大劑量/相臨劑量)

P0:陽性反應率之和

Pm:大陽性反應率

Pn:小陽性反應率

 

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