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小鼠支氣管平滑肌細胞的分離培養方法

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平滑肌即無紋肌的通稱,平滑肌是由長紡錘形的單核細胞構成。它不構成獨立的器官,而隻是成為構成體壁和內髒壁的因素(肌層)。平滑肌細胞互相連接,形成管狀結構或中空器官;在功能上可以通過縮短和產生張力使器官發生運動和變形,也可產生連續收縮或緊張性收縮,使器官對抗所加負荷而保持原有的形狀。

小鼠支氣管平滑肌細胞的收縮、舒張、增殖和凋亡與臨床許多疾病的病理生理過程有關.如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等。例如在哮喘發病時,可以檢測到氣管平滑肌發生數目的增生和肥大,表型也發生改變,由收縮型轉為合成型與分泌型,並分泌多種與細胞因子;而且出現向氣管腔遷移的跡象。

 

小鼠支氣管平滑肌細胞來源於實驗動物正常支氣管組織長梭狀細胞,貼壁培養。通過平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫熒光染色鑒定為陽性鑒定純度高於90%不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

1.試驗所需儀器設備及試劑

(1)儀器

儀器名稱

規格型號

廠家

生物安全櫃

BSC-1500ⅡA2-X

濟南鑫貝西生物技術有限公司

CO2細胞培養箱

BC-J160S

上海博迅實業有限公司

熒光倒置顯微鏡

DS-Ri2

Nikon

高速冷凍離心機

Multifuge X1R

Thermo Fisher

電熱恒溫鼓風幹燥箱

DHG-9123A

上海精宏實驗設備有限公司

(2)試劑耗材

試劑名稱

規格/貨號

廠家

T25細胞培養瓶

430639

Coming

血球計數板

Neubauer improved

Marienfeld

細胞培養孔板

WHB-24

上海臥宏生物科技有限公司

平滑肌細胞完全培養基

PriMed-iCell-004

绿巨人全网无限播放(上海)生物技術股份有限公司

0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

1734858

Gibico

 

2.小鼠支氣管平滑肌細胞的分離培養

1) 取4-5周齡的小鼠,斷頸處死後,泡於75%的酒精中,

2) 剖開胸腔,取出完整氣管及肺組織,放入無菌PBS中,

3) 在體視顯微鏡下,小心分離出下遊支氣管,

4) 用眼科剪及鑷子分離肌層並剪碎,

5) 加入0.1% I + II + IV + dispase,4℃過夜消化,

6) 第二天置於37℃水浴搖床中消化2~3h,

7) 待液體變渾濁後加入完全培養基終止消化,充分吹打,

8) 過100目篩網,收集濾液,1000rpm離心5min,棄去上清,

9) 用完全培養基重懸沉澱,鋪瓶。

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