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绿巨人全网无限播放 || 原代小鼠心肌成纖維細胞分離和培養方法

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       小鼠心肌成纖維細胞的組織來源於實驗動物的正常心髒組織,心髒是脊椎動物身體中重要的一個器官,主要功能是提供壓力,把血液運行至身體各個部分。心髒的作用是推動血液流動,向器官、組織提供充足的血流量,以供應氧和各種營養物質,並帶走代謝的終產物(如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等),使細胞維持正常的代謝和功能。
       心髒中,心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數的60%-70%,是心髒中非心肌細胞的主要組成部分,廣泛存在於心髒組織中,包圍心肌細胞,連接心肌細胞間質,與缺血性心髒病、炎症、肥大、梗死等病理狀態密切相關。細胞生長方式以長梭狀細胞,貼壁培養。

       小鼠心肌成纖維細胞的方法有很多,绿巨人全网最好的破解app聚合平台提供的心肌成纖維細胞分離方法有兩種,一種是貼塊法,一種是消化法,這兩種方法都可以用於分離和培養原代細胞。

       實驗器械:
       1.培養皿
       2.T-25細胞培養瓶
       3.100目不鏽鋼網篩
       4.200目不鏽鋼網篩
       5.眼科剪
       6.眼科鑷
       7.離心管(15ml、50ml)

       實驗分離和培養步驟:

       1. 小鼠頸椎脫臼處死後,剃除腹胸部的被毛,放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。

       2. 取出小鼠,在無菌環境下打開胸腔,取出心髒組織,注入盛有無菌1×PBS的培養皿中,洗淨組織表麵的血液。

       3. 將清洗幹淨的心髒組織轉入裝有75%酒精的培養皿中浸泡15s以殺死大多數的心髒被膜細胞,浸泡完成後立即轉入裝有無菌1×PBS的培養皿中震蕩清洗。

       4. 清洗完成後,用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織,僅保留心室部分,再次用1×PBS清洗去除心室內的血液。

       5. 將清洗幹淨的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊,之後用PBS清洗若幹次後按下述兩種方法之一進行後續操作。

       A.貼塊法

       6. 將清洗好的碎塊轉入另一培養皿中,用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織,室溫消化3-5min。

       7. 消化完成後,添加數毫升FBS終止消化,之後吸棄液體,加PBS清洗組織塊1伺次後,用200ul吸頭將組織塊平均接種於T-25培養瓶的培養麵上,之後將培養瓶放置於37℃二氧化碳培養箱中,靜置2-4h。

       8. 待組織處於略微脫水的狀態時,小心添加2ml完全培養基,添加時注意盡量不要將組織塊衝起,要使培養基接觸所有的組織塊。

       9. 之後放入培養箱中繼續培養,一般2-4天後成纖維細胞會從組織塊周圍爬出,待爬出的細胞有較多數量時,可將細胞消化下來,去除組織塊,轉入另一培養瓶中培養。

       B.消化法

       6. 將清洗好的碎塊轉入另一離心管中,加入混合消化液(0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶)37℃水浴消化8min後,吸取上層混懸液棄去。

       7. 餘下組織加入混合消化液10ml,37℃水浴震蕩消化10min;吸取上層懸液至另一離心管中,加入適量FBS終止反應;剩餘沉澱物再加消化液消化3-5次,直至組織塊完全消化。

       8. 按1∶1加入含血清的培養基,中止酶反應,懸液過150目網篩去除較大的組織塊。

       9. 收集全部中止後的消化液於離心管中,300g,離心10 min,棄去上清,加入培養液重懸細胞後計活細胞數。

      10. 調整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養瓶中,每瓶添加2ml細胞懸液。

      11. 培養瓶放置於37℃,5% CO2培養箱中靜置40min後,吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞,再添加5ml完全培養基繼續培養。

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