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養細胞需要注意的細節

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養細胞可謂是個精細活,從事養細胞的人都知道養細胞的時候一旦不注意,就很容易造成細胞汙染,所以想要養好細胞除了小心謹慎以外,還要提前做好準備:
細胞培養前的準備
1)在帶上手套開始細胞培養之前,先檢查一下移液管和瓶子的數量是否充足,以免在開始實驗後再次出入操作台,這樣可以降低細胞汙染的風險。
2)細胞培養基也應先預熱,選擇隻預熱部分培養基而非整瓶加熱,不但可以節約實驗時間,而且可以避免因反複加熱培養基而造成的蛋白質降解。

3)結束操作後,別忘了培養基對光敏感,應盡可能避光保存。

細胞培養的定期檢查
1)定期檢查培養細胞的形態,即形狀和外觀,對於細胞培養實驗取得成功至關重要。
2)除確認細胞的健康狀態外,每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發現汙染征象,避免汙染擴散至實驗室其他細胞。
       細胞變質的征象
1)細胞變質的征象包括核周出現顆粒、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成。
       2)這些變質征象可能為多種原因所致,例如:培養物汙染、細胞係衰老或培養基中存在毒性物質,或者這些征象僅表明培養物需要更換培養基。

       3)變質嚴重時將會成為不可逆的變化。

       細胞培養通風櫥的消毒及布局
       1)保持細胞培養通風櫥內的整潔有序,將所有物品置於直視範圍內。
       2)向放入通風櫥內的所有物品噴灑70%乙醇,擦拭清潔進行消毒。
       3)在通風櫥中部開闊處放置細胞培養容器;移液器置於右前方易於取用;試劑和培養基置於右後方便於吸取;試管架置於中後部;小型容器置於左後部用於盛放廢液。
       培養瓶/皿等物品的無菌操作
       1)無菌培養瓶、試劑瓶、培養皿等物品使用時方可揭開蓋子,不得將其開放暴露於環境中,操作完成後盡快蓋上蓋子,取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作台麵上。
       2)進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗,以盡量避免汙染。
       細胞培養中可能的汙染物
       1)細胞培養汙染物主要分為兩類:
        a.化學汙染物,如培養基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去汙劑。
        b.生物汙染物,如細菌、黴菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞係的交叉汙染。
        c.可通過充分了解汙染源以及采用良好的無菌技術,降低汙染發生的頻率和嚴重程度。
        交叉汙染的確認
        1)交叉汙染雖不如微生物汙染普遍,但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞係間廣泛的交叉汙染是個明確的問題,會造成嚴重後果。
        2)從聲譽好的細胞庫獲取細胞係、定期檢查細胞係性質及采用良好的無菌技術有助於避免交叉汙染。
        3)通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉汙染。
        細胞換液注意事項
       1)為細胞換液時,要沿著培養瓶的一側輕輕地加入,而不是直接加到細胞中,以免損傷細胞,當培養的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。
       2)使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時,每支吸管隻能使用一次,以免交叉汙染。
       細胞傳代的時間把握
       1)當細胞呈指數增殖,貼壁培養的細胞已占據所有可用基質、沒有擴增空間,或懸浮培養的細胞已超過培養基質所支撐的能力,無法進一步生長時,細胞增殖速度將大大降低甚至完全停止。
       2)為了將細胞密度維持在zui佳水平,以便細胞繼續生長,並且刺激進一步增殖,必須對細胞進行傳代。
       細胞培養中使用抗生素的注意事項
      1)細胞培養時不應長期使用抗生素,因為連續使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生,導致輕度汙染持續存在。
      2)抗生素隻能作為對付汙染的zui後手段短期使用,並盡快撤除。
      3)如果長期使用抗生素,則應同時進行無抗生素培養,以便作為鑒別隱性感染的對照。
       細胞凍存的必要性
       1)連續培養的細胞係容易發生遺傳漂變,有限細胞係zui終會發生衰老,所有培養的細胞都易受到微生物汙染,即使運轉情況的實驗室也會遇到設備故障的問題。

       2)由於已建立的細胞係是一種寶貴資源,更換細胞係成本高昂,而且耗費時間,因此,必須將其冷凍起來,長期保存。

 

細胞凍存的事項
1)應在細胞濃度高的情況下進行細胞培養凍存,並且細胞傳代的次數盡可能少。
2)在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%。請注意,zui佳凍存條件取決於所用細胞係。
3)凍存和複蘇過程對大多數細胞都會造成不利影響,因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養瓶的方法使細胞脫落(培養昆蟲細胞時除外),也不要高速離心細胞。
凍存培養基的選擇
1)凍存細胞時必須選擇凍存培養基,凍存培養基中應含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。
2)還可使用專門配製的完全凍存培養基,例如HyClone、Gibco的細胞凍存培養基。
細胞培養溫度的設定
1)細胞培養的zui佳溫度主要取決於細胞供體的體溫,此外也受到解刨部位體溫差異的影響,例如:皮膚溫度低於骨骼肌的溫度。
2)與溫度過低相比,細胞培養時溫度過高時更為嚴重的問題:因此,往往將培養箱的溫度設定為略低於zui佳溫度。
各類細胞培養的zui佳溫度
1)大多數人和哺乳動物細胞係在36℃~37℃下具有zui佳生長狀態。
2)昆蟲細胞在27℃具有zui佳生長狀態;在低於27℃以及27至30℃範圍內,細胞生長較慢。
3)溫度超過30℃時,昆蟲細胞活力降低,即使溫度降至27℃,細胞活力也無法恢複。
4)禽類細胞係在38.5℃時具有zui佳生長狀態。雖然此類細胞也可在37℃下培養,但其生長速度會變慢。
5)來源於冷血動物(例如:兩棲動物、冷水魚)的細胞係可耐受很寬的溫度範圍,為15-26℃。
6)請注意每種細胞的培養條件均有所不同,偏離某種細胞所需的培養條件會導致細胞表型異常,甚至培養完全失敗。
細胞培養的zui適pH
1)大多數正常的哺乳動物細胞係都能在pH值為7.4的環境中生長良好,而且不同細胞株間差異極小。
2)但是,目前發現有些轉化細胞係在輕度偏酸性的環境中即pH7.0-7.4時生長較好,而有些正常的成纖維細胞係更適合輕度偏堿性的環境即pH為7.4-7.7。
3)Sf9和Sf21等昆蟲細胞係在pH值為6.2的環境中生長。
細胞培養基zui適pH的控製
1)細胞培養基可控製培養體係的pH值,為培養的細胞緩衝pH值的變化。這種緩衝作用通常是通過添加有機緩衝鹽(例如:HEPES)或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩衝鹽實現。
2)由於培養基的pH值取決於溶解態二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡,因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養基的pH值。
3)為此,使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩衝鹽培養基時必須使用外源性二氧化碳,特別是使用開放式培養皿培養細胞或者進行高濃度的轉化細胞係培養時。
細胞培養中血清的保存
1)細胞培養中所用的血清不盡相同,您需要根據您所培養的細胞種類和培養要求來挑選出的血清。建議將血清保存在-10至-20℃,若存放於4℃,請勿超過一個月。若無法一次用完一瓶,建議您將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內,再放回冷凍箱保存。
2)解凍血清時,建議您將血清從冷凍箱取出後,先置於2-8℃冰箱過夜融解,然後在室溫下使之全融。需要注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。
如何在細胞鋪板時避免“邊緣效應”
1)細胞實驗鋪板時,為避免“邊緣效應”,以應用96孔板的中間60孔為zui佳,一般四周的一圈邊緣孔不養細胞,隻做空白或陰性對照。
2)鋪板時,細胞懸液一定要混勻,以避免細胞沉澱下來而導致每孔中的細胞數量不等,可以每接幾個就再混勻一下。
3)加樣器操作要熟練,盡量避免人為誤差。此外,吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練操作,盡快上板。
何時選擇使用熱滅活血清
1)加熱血清可以滅活補體係統。
2)啟動的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,啟動淋巴細胞和巨噬細胞活化。
3)在免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。
熱滅活血清可能出現的現象
1)在免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。而對於其他大多數的細胞來說是不需要熱滅活血清的。
2)熱滅活血清對細胞的生長隻有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至可能因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低;經過熱處理的血清,沉澱物會顯著地增多,這些沉澱物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受汙染,而把血清放在37度環境中,又會使此沉澱物增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
3)根據自己的研究需要是否需要熱滅活血清。如此一來,不但能確保血清的質量,而且能夠節省實驗時間。
如何正確熱滅活血清
1)熱滅活時請將血清置於56℃水浴30分鍾。
2)為盡量減少熱滅活對血清品質的影響,一次滅活的血清體積不宜過大。

3)準備同樣的容器裝相等體積的水(與血清相同溫度),滅活時將裝有血清和水的容器同時放入56℃水浴,在裝水的容器中放置溫度計,加熱過程中不時地輕輕旋轉混勻血清,當溫度計顯示達到56℃左右,開始計時。

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