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製成免疫熒光容易出現的問題和注意事項

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在製作原代細胞免疫熒光時,容易出現一些問題,造成熒光鑒定失敗,將抗原或抗體標記上熒光素,製成熒光抗體檢測組織或細胞內的相應抗原(或抗體)時,一定要注意抗體的比例高低和濃度。

製作免疫熒光常用的方法有:

方法一:直接法

步驟:將熒光標記的特異性抗體(抗原)直接加在抗原(抗體)上,經一定的溫度和時間染色,水洗—幹燥—封片—鏡檢

優點:操作簡便、特異性高、非特異性染色少

缺點:敏感性低

方法二:間接法

步驟:先用已知未標記的特異性抗體(一抗)與抗原反應,再用標記的抗體(二抗)與其反應,形成抗原—抗體—抗體複合物,水洗—幹燥—封片—鏡檢

優點:敏感性強,目前多采用間接法

缺點:操作複雜

實驗過程中常見的問題:

1,整個細胞片都出現熒光高點

原因有二:一是二抗濃度過高,適當降低二抗濃度即可。二是二抗發生沉澱,可以使用過濾或者離心熒光標記二抗

2,信號弱或無信號,染色細胞過少

目標蛋白在細胞中沒有表達,需要製備細胞裂解液,用Western   Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達

表達目標蛋白的細胞過少標本中使用更多的細胞,試用其他瞬時轉染方法,或者使用穩定轉染細胞係

細胞通透性差需要增加通透劑作用的時間或者濃度,或改用其它的通透劑

染色前的固定步驟破壞了抗原表位,改用其他固定方法。

通透使抗原丟失,可以減少通透劑作用的時間或強度。

抗體不識別,需要換用其他抗體

一抗稀釋度過大使用同一樣品按zui佳的二抗用量作一抗稀釋曲線,以確定zui佳的一抗稀釋比例。

二抗選擇錯誤要使用正確的二抗

3,鏡下觀察隻有DAPI的藍光,目的熒光幾乎沒有或者很弱

出現這種現象很有可能是抗體比例太低,需提高抗體濃度,可配合提高二抗濃度;共聚焦的激發熒光強度不夠大;二抗孵育時是否是對應的種屬,比如本來需要山羊抗鼠結果加為山羊抗兔

4,細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點

這種情況一般是支原體汙染所致,建議用殺支原體藥2周後再檢測,或者通過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體熒光

 

 

5,如何共定位的視野

共定位時,首先判斷哪些細胞是轉染成功的,比如我過表達了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關係,則在視野中尋找已成功轉染蛋白A的細胞,一般熒光強度會顯著高於周邊其他細胞,再在這個細胞上觀察蛋白B的表達。

6,視野中細胞與細胞之間存在散在的發光點

有兩種情況可造成:1,拍照時PBS量過少引起的非特異性;2,PBS未過濾,未溶解的殘渣黏附而導致

三、除此之外,這些注意事項也要牢記

1、合適的抗體稀釋比例

通過優化抗體稀釋比例來優化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原,強烈建議濃度梯度實驗。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用隻有二抗染色的片子

3、細胞固定和通透

為達到zui佳的檢測效果,細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵,細胞和抗原需要保證zui佳的結構,並利於抗體與抗原結合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實現:細胞用2%-4%多聚甲醛固定,之後用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理,但是對於核內抗原可能無效,需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時,要注意它會引起細胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外,細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透,可以避免去垢劑的使用。

4、封閉條件的優化選擇

為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前用封閉液封閉,這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清,一般來說,血清價格比較昂貴,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以說是的封閉血清。另外封閉時間不易過長,30-60min即可,且封閉後不用洗滌,直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的選擇

封閉過後需要一抗孵育,可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h,以筆者的經驗是一抗孵育4度過夜比較好,抗原抗體結合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說明書來,再根據自己具體的實驗要求進行優化。如果抗體濃度過低,會造成信號太弱,如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團信號強於Dylight強於FITC。如果做免疫雙標,一抗要來自不同種屬,熒光二抗的光譜也要分開。

 

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